分光光度计的工作原理主要是基于琅伯-比尔定律，18世纪初，琅伯在前人的基础上，进一步研究了物质对光的吸收与物质厚度的关系，并于1760年指出：如果溶液的浓度一定，则光对物质的吸收程度与它通过的溶液厚度成正比，这就是琅伯定律，其数学表达式为：

A=lgI。/I=K。b

式中，A为吸光度；I。为入射光强度；I为透射光强度；b为液层厚度（即光程）；K。为比例常数。

1852年，比尔研究了各种无机盐的水溶液对红光的吸收后指出：光的吸收和光所遇到的吸光度的数量有关；如果吸光物质于不吸光的溶剂中，则吸光度和吸光物质的浓度成正比，这就是比尔定律，其数学表达式为：

A=lgI。/I=K1C

式中，A为吸光度；I。为入射光强度；I为透射光强度；C为溶液的浓度；K1为比例常数。

将琅伯定律和比尔定律结合起来，则为琅伯-比尔定律，公式如下：

A=lgI。/I=K2bC

式中，A为吸光度；I。为入射光强度；I为透射光强度；C为溶液的浓度；b为液层厚度（即光程）；K1为比例常数。

比尔定律认为：当一束光平行的单色光通过某一均匀的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和光程的乘积成正比，这就是琅伯-比尔定律的真正物理意义，它是光度分析中定量分析的zui基础、zui根本的依据，也是紫外可见分光光度计的基本原理。